倍贊氏金蠅PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

原理是由一對引物介導，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進行快速酶促擴增，經(jīng)過n個熱循環(huán)擴增，擴增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴增效率＝倍，使得檢測擴增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
 特異性強
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
?
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

蘇云金芽孢桿菌 Bacillus thuringiensis木耳 Auricularia auricula

麥迪、麥白霉素檢定培養(yǎng)基/Medecamycin Medium250克國產(chǎn)/進口

人胚腎細胞英文名稱：AAV-293

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae熱帶假絲酵母 Candida tropicalis

M-TGE肉湯/M-TGE Broth奶制品中濾膜細菌計數(shù)250克國產(chǎn)/進口

人腺成纖維細胞*培養(yǎng)基100mL

泡盛曲霉 Aspergillus awamori克魯斯假絲酵母 Candida krusei

PC-3M-2B4(人前列腺低轉(zhuǎn)移細胞株)5×106cells/瓶×2

HEL(人紅白細胞白血病細胞)5×106cells/瓶×2

Caki-1, 人腎透細胞皮膚轉(zhuǎn)移細胞SiHa(人頸鱗細胞)

MPC-11(小鼠漿細胞瘤)5×106cells/瓶×2gersion

倍贊氏金蠅PCR檢測試劑盒說明書人關(guān)節(jié)軟骨細胞*培養(yǎng)基100mL

YT肉湯/YT BrothBR250克國產(chǎn)/進口

豌豆瘤菌 Rhizobium leguminosarum釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

RIN-m5f(大鼠胰島β細胞瘤細胞)5×106cells/瓶×2

小鼠腸靜脈內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基SW-13(人腎上腺皮質(zhì)細胞)

NCI-H1975(人肺腺細胞)5×106cells/瓶×2

小鼠膀胱平滑肌細胞*培養(yǎng)基豇豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium vigna

凝結(jié)芽孢桿菌 Bacillus coagulans虎皮香菇，漏斗香菇 Lentinus tigrinus

改良Frey氏培養(yǎng)基基礎(chǔ)/Frey Medium Modified Base250克國產(chǎn)/進口

苜蓿中華瘤菌 Sinorhizobium meliloti宇佐美曲霉 Aspergillus usamii

鈉血瓊脂基礎(chǔ)/Sodium Chloride Blood Agar Base副溶血性弧菌的溶血試驗250克國產(chǎn)/進口

技術(shù)原理：
 DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。
       在聚合酶鏈式反應(yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。（ DNA高溫變性低溫復性）
       發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。